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    線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書
    更新時(shí)間:2019-02-26 點(diǎn)擊量:1841

    貨號(hào)YJ1219                                         規(guī)格:100管/48樣

    線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書

    微量法

    正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

    測(cè)定意義:

    線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,也可逆過程水解ATP。此外,復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

    測(cè)定原理:

    復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,通過測(cè)定Pi增加速率來測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。

    需自備的儀器和用品:

    可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

    試劑的組成和配制:

    試劑一:100mL×1 瓶,-20℃保存;

    試劑二:80mL×1 瓶,-20℃保存;

    試劑三:2mL×1 瓶,-20℃保存;

    試劑四:粉劑×1 支,-20℃保存;臨用前加入2mL蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;

    試劑五:8mL×1 瓶,4℃保存;

    試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入4mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

    試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

    試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

    試劑九:液體 10mL×1 瓶,室溫保存。

    定磷試劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染(請(qǐng)根據(jù)需要,用多少配多少)。

    注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

    樣本的前處理:

    組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

    ① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

    ② 將勻漿 600g,4℃離心 5min。

    ③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。

    ④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ(此步可選

    做)。

    ⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入800uL試劑二和8uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測(cè)定。

    測(cè)定步驟:

    • 酶促反應(yīng)(在EP管中加入下列試劑)

    試劑名稱(μL)

    對(duì)照管

    測(cè)定管

    試劑四

    20

    20

    試劑五

    80

    80

    樣本

     

    100

    混勻, 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴 30min

    試劑六

    40

    40

    樣本

    100

     

    混勻,4000g,25℃離心 10min,取上清液

    • 定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑)

    上清液

    30

    30

    定磷試劑

    170

    170

    混勻,室溫靜置10min后,在660nm處讀取A測(cè)定管和A對(duì)照管,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

    復(fù)合體Ⅴ活性計(jì)算:

    a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:

    標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y= 1.2487x + 0.0361;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),y為A 值。

    1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:

    (1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

    單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

    復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

    此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

    (2)按樣本鮮重計(jì)算

    單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

    復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min /g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

    (3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

    單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

    復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)

    V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.4×10-4 L; V 樣:加入樣本體積,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

    b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:

    標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y=0.624x + 0.0361;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),y 為A 值。

    1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:

    (1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

    單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

    復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

    此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

    (2)按樣本鮮重計(jì)算

    單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

    復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=103.4× (ΔA-0.0361) ÷W

    (3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

    單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

    復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min /104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.206× (ΔA-0.0361)

    V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.4×10-4 L;V 樣:加入樣本體積,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

     

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