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    AxyPrep 無內毒素質粒大量試劑盒
    更新時間:2019-10-31 點擊量:2461

     

     

     

     

    AxyPrep 無內毒素質粒大量試劑盒

     

    本試劑盒采用 SDS 堿裂解法,結合 DNA 制備膜選擇性吸附 DNA。同時采用特殊溶液(Buffer ETR 和 Buffer PF)有效去除內毒素,可從 80-200 ml 細菌培養物中提取出多至 500 高純度質粒 DNA,其內毒素水

     

    平控制在 0.1 EU/ 以下。

     

    一、 試劑盒組成、貯存、穩定性

     

     

    Cat. No.

    AP-MX-EP-2

    AP-MX-EP-10

    AP-MX-EP-25

     

    制備次數

    2 preps

    10 preps

    25 preps

     

    制備管(Maxiprep column

     

    2

     

    10

     

    25

     

    大量濾器(Maxiprep syringe filter

     

    2

     

    10

     

    25

     

    RNase A

    48 µl

    270 µl

    700 µl

     

    Buffer S1

    24

    ml

    115

    ml

    285

    ml

     

    Buffer S2

    24

    ml

    115

    ml

    285

    ml

     

    Buffer S3K

    24

    ml

    115

    ml

    285

    ml

     

    Buffer B

    24

    ml

    115

    ml

    285

    ml

     

    Buffer W1

    3

    ml

    160

    ml

    350

    ml

     

    Buffer W2 concentrate

    15

    ml

    66

    ml

    150

    ml

     

    ET-free water (70% Ethanol)

    1.8

    ml

    7.5

    ml

    18

    ml

     

    Eluent A

    8

    ml

    30

    ml

    70

    ml

     

    Buffer ETR

    10

    ml

    50

    ml

    120

    ml

     

    Buffer PF

    3

    ml

    13

    ml

    30

    ml

     

    說明書

     

    1

     

    1

     

    1

     

    RNase A50 mg/ml,室溫可貯存 6 個月,長期貯存于-20℃。

     

    Buffer S1:細菌懸浮液。加入 RNase A 后,混合均勻,4℃貯存。

     

    Buffer S2:細菌裂解液(含 SDS/NaOH),室溫密閉貯存。

     

    Buffer S3K:中和液,室溫密閉貯存。

     

    Buffer BDNA 結合溶液,室溫密閉貯存。

     

    Buffer W1:洗滌液,室溫密閉貯存。

     

    Buffer W2 concentrate:去鹽液。使用前,按試劑瓶上的體積加入無水乙醇(可用無水乙醇或 95%乙醇)?;旌暇鶆颍覝孛荛]貯存。

     

    ET-free water (70% Ethanol):使用前,按試劑瓶上的體積加入無水乙醇(可用無水乙醇或 95%乙醇)?;旌暇鶆?,室溫密閉貯存。

     

    Eluent A:洗脫液。室溫密閉貯存。Buffer ETR:內毒素去除液。室溫密閉貯存。

    Buffer PF:分相緩沖液。室溫密閉貯存。

    二、 注意事項

    1.細菌過量將影響細菌裂解、質粒 DNA 的釋放,導致內毒素含量過高。

    2.步驟 3 和步驟 4 的操作必須溫和。劇烈搖晃將導致基因組 DNA 的污染。但混合必須充分,否則影響得率。

    3.在加入 Buffer S3K 時,蛋白質和基因組 DNA 形成粘稠的白色絮狀沉淀,必須充分混合均勻,使凝集塊中間也得到充分中和凝結。

    4.Buffer S2、Buffer S3K、Buffer B  Buffer W1 含刺激性化合物,操作時要戴乳膠手套和防護眼鏡,避免沾染皮膚、眼睛和衣物,謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時,要立即用大量清水或生理鹽水沖洗,必要時尋求醫療咨詢。

    三、 實驗準備

    第yi次使用前,RNase A 全部加入 Buffer S1 中,4℃貯存。

    yi次使用前,Buffer W2 concentrate 中加入體積的無水乙醇。

    yi次使用前,ET-free water (70% Ethanol)中加入體積的無水乙醇。使用前置于-20℃預冷。

    使用前,檢查 Buffer S2 是否出現沉淀,如出現沉淀,應于 37℃溫浴加熱溶解并冷卻至室溫后使用。

    Eluent A  65℃預熱后使用,有利于提高質粒得率。

    Buffer S3K、Buffer B  Buffer ETR 使用前置于 4℃預冷。

    準備無核酸和核酸酶污染的 Tip 頭、50ml 離心管。

    水平離心機(轉速可達到 4,000×g)及冷凍離心機(轉速可達到 8,000×g

    準備 56℃水浴。

    四、 操作步驟

    • 80-200 ml 在 LB 培養基中培養過夜的菌液(若使用豐富培養基,菌液體積應減半或更少),3,000 ×g 離心 8 min,棄上清。將離心管倒置于紙巾上 1 min,除盡上清。
      • 一般過夜培養的菌液 OD600 在 2.0-4.0 之間。若菌液 OD600 >4,菌量需減少。

    10 ml Buffer S1,懸浮細菌沉淀,懸浮需均勻,不應留有小的菌塊。

    確認 Buffer S1 中已加入 RNase A。

    • 10 ml Buffer S2,溫和并充分地上下翻轉混合均勻使菌體充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過 5 min。
      • Buffer S2 使用后立即蓋緊瓶蓋,以免空氣中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH,降低溶菌效率。

    避免劇烈搖晃,否則將導致基因組 DNA 污染。

    此步驟不宜超過 5 min 

    • 10 ml 4℃預冷的 Buffer S3K,溫和并充分地上下翻轉混合,直至溶液顏色均一并形成緊實的凝集塊,室溫放置 5 min。
      • 加入 Buffer S3K 后應立即混合,以避免形成局部的凝結塊。

     

    避免劇烈搖晃,否則將導致基因組 DNA 污染。

     

    5.10 ml 4℃預冷的 Buffer B,溫和并充分地上下翻轉混合 10 次,8,000×g 離心(4℃)10 min。

     

     

    步驟 6-9 可以選擇離心法或負壓法。

     

    • 離心法:

     

    6A. 先將大量制備管放入 50 ml 離心管中。吸取步驟 5 中的混合液,轉移到大量濾器Maxiprepsyringe filter中。

     

    7A. 插入推桿,垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,6,000×g 離心 5 min。 8A. 棄濾液,加 12 ml Buffer W1 至制備管中,6,000×g 離心 5 min。

    9A. 棄濾液,加 14 ml Buffer W2 至制備管中,6,000×g 離心 5 min。

    確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。

    • 負壓法:

    6B. 正確連接負壓裝置,將大量制備管插到負壓裝置的插口上。

    7B. 吸取步驟 5 中的上清液,轉移到大量濾器中,插入推桿,垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,開啟并調節負壓至-25 ~ -30 英寸汞柱,緩慢吸走管中溶液。

    8B. 保持負壓,加 12 ml Buffer W1,吸盡管中溶液。

    9B. 保持負壓,加 14 ml Buffer W2,吸盡管中溶液。

    確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。

    再在大量制備管中加 4 ml Buffer W26,000×g 離心 5 min

    將制備管置于另一潔凈 50 ml 離心管中,在制備管膜中央加 2 ml Eluent A,室溫靜置 5 min6,000×g 離心 5 min 收集質粒 DNA。

    Eluent A 加熱至 65℃將提高洗脫效率。

    棄制備管。在濾液中加入 4 ml 預冷的 Buffer ETR,混合均勻。

    如果 Buffer ETR 渾濁,于冰上靜置,直至溶液變得清亮;如果分層,則混合均勻。

    加入 1 ml Buffer PF,混合均勻。

    *溶液可能會出現微弱的渾濁現象,此為正常現象。

     

    置于 56°C 孵育 8 min。室溫 4,000×g 離心 5 min。

     

    • 孵育后溶液將出現大量乳白色沉淀,否則延長孵育時間。

     

    • 孵育后溶液有可能出現分層現象,此為正常現象。

     

    • 此步驟的離心必須使用吊籃式(swing-out rotor)離心機或其他水平離心機

    取無色上相至 50 ml 離心管中,加入 0.8 倍體積異丙醇(如:取得 6 ml 無色上相,則加入 4.8 ml 異丙醇),混合均勻。室溫靜置 10 min8,000×g 離心 10 min

    • 盡可能棄盡上清。加入 2 ml 預冷的 ET-free water70% Ethanol,洗滌沉淀,8,000×g 離心 5 min。

     

    • ET-free water70% Ethanol)使用前確定已加入體積的無水乙醇。

     

     

    • 盡可能棄盡上清。在超凈臺中干燥 10-15 min

     

    • 管壁上殘留液體可短暫離心后吸棄。

     

     

    • 加入 500  Eluent A 或無內毒素水溶解質粒 DNA。

     

     

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