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    酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)基本原理
    更新時(shí)間:2011-06-14 點(diǎn)擊量:2600

      1971EngvallPerlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assayELISA)用于IgG定量測定的文章,使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。這一方法的基本原理是:①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時(shí),把受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,故可極大地地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

    方法類型和操作步驟

      ELISA可用于測定抗原,也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑:①固相的抗原或抗體,②酶標(biāo)記的抗原或抗體,③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件,可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。

     (一)雙抗體夾心法  雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,操作步驟如下:

      (1)將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

      (2)加受檢標(biāo)本:使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間,讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

    3)加酶標(biāo)抗體:使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

      (4)加底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

      根據(jù)同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。

      (二)雙位點(diǎn)一步法

      在雙抗體夾心法測定抗原時(shí),如應(yīng)用針對抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體,則在測定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步(圖15-5)。這種雙位點(diǎn)一步不但簡化了操作,縮短了反應(yīng)時(shí)間,如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體,測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

      在一步法測定中,應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect),類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時(shí),過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成夾心復(fù)合物,所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。<br>

    (三)間接法測抗體

      間接法是檢測抗體zui常用的方法,其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:

      (1)將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

      (2)加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合,在洗滌過程中被洗去。

      (3)加酶標(biāo)抗抗體:與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合,從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體,可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。  (4)加底物顯色:顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。

      本法只要更換不同的固相抗原,可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。

      (四)競爭法

      競爭法可用于測定抗原,也可用于測定抗體。以測定抗原為例,受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合,因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下:

      (1)將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌。

      (2)待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原,則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原,則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合,競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì),使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原,保溫后,酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)zui充分的量。洗滌。   (3)加底物顯色:參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原zui多,故顏色zui深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差,代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測管顏色越淡,表示標(biāo)本中抗原含量越多。

      (五)捕獲法測IgM抗體

      血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在,后者會(huì)干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下:

      (1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上,形成固相抗人IgM。洗滌。

      (2)加入稀釋的血清標(biāo)本:保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。

      (3)加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。

      (4)加入針對特異性的酶標(biāo)抗體:使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。

      (5)加底物顯色:如有顏色顯示,則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在,是為陽性反應(yīng)

      (六)應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

    親和素是一種糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成,可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素(strepavidin)。生物素(biotin)又稱維生素H,分子量244.31,存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物,生物素-羥

     

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