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    pBM16A Toposmart Cloning Kit常見問題分析
    更新時間:2021-03-10 點擊量:2450

    pBM16A Toposmart Cloning Kit

     

     

    產品信息:

     

    組 成

    YCL071-01

    YCL071-02

    pBM16A Vector (20ng/ml )

    20ml

    20ml×3

    10×Toposmart

    20ml

    20ml×3

    Control Insert

    5ml

    5ml

    M13F Primer

    0.1OD

    0.1OD×3

    M13R Primer

    0.1OD

    0.1OD×3

    保存條件:-20℃保存,有效期一年。

    產品介紹:

    pBM16A Toposmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓撲異構酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中。不僅適用于克隆由PfuKODXeroxPhusion Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產物,也可克隆由TaqTthklenTaqDNA聚合酶擴增的帶A尾的PCR產物。試劑盒中的pBM16A載體為線性化的質粒。可以用引物對M13FM13R進行菌落PCR鑒定陽性克隆。

    產品特點:

    1連接反應僅需5 分鐘。

    2適用于平末端PCR產物和帶A尾的PCR產物。

    3載體采用了新的制備工藝,無需藍白斑篩選

    1. 克隆位點兩旁都有Smal和EcoR V酶切位點,適合單酶切鑒定。
    2. 載體具有氨芐青霉素抗性。

    操作步驟:

    1. 連接反應

    按下表,在一個0.2ml PCR 管中依次加入加完試劑后,輕輕混勻低速離心,使溶液集中在管底。

    成分

    體積

    DNA -*片段

    0.5-8µl

    pBM16A Topo載體

    1ml

    10×Toposmart

    1ml

    補水至總體積

    10ml

     注意:此步驟不要在低溫條件下(冰水浴)上操作。

     2. 反應溫度及片段要求

    室溫下20-30℃)放置 0-5 分鐘,然后將離心管放置在冰上。如當天不進行轉化實驗。請將連接產物置于-20℃保存。

    注意:DNA-*片段的用量見下表

     

    片段大小(bp

    建議用量(ng

    100-1000

    20-50

    1000-2000

    50-100

    2000-5000

    100-200

     

    室溫下20-30℃)反應時間 5-30 分鐘,如果室溫較低,推薦使用 PCR 儀器控制溫度。可以設置 25℃反應 5 分鐘。如果 PCR 產物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶,無引物二聚體和非特異性條帶存在,可直接取 0.5-1µl PCR 產物原液進行克隆。

    3. 陽性對照反應

    1µl 試劑盒提供的1kb長度的對照片段LacZ 基因α肽片段進行克隆,轉化具有α 互補功能的大腸桿菌感受態細胞( DH5α,*0,Mach1-T1 。菌液涂布在含有IPTG,X-gal LB 氨芐平板上,次日藍色菌落為陽性克隆,說明有片段插入,白色菌落為空載體。

    4. 轉化

    1.5µl 連接產物到50-100µl 剛剛融化的感受態細胞中,輕輕混勻,冰浴2-30 分鐘。

    2.42℃水浴中熱擊30 秒鐘。

    3. 立刻置于冰水浴中2 分鐘。

    加入300-500µl 無菌的不含抗生素的SOC LB37℃,200-250rpm 振蕩培養60 鐘。

    注:小于 2kb 片段可以不復蘇,直接涂平板。

    • 吸取200µl 菌液涂布。為了得到更多的菌落,可以先4000rpm 離心1 分鐘,去掉部分上清,用移液器輕吹菌體,充分懸浮菌液,取全部菌液涂布,然后 37℃培養過夜12-16 小時

    5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR

    (1) 菌落PCR方法鑒定陽性克隆

    ① 用10ml吸頭挑選克隆至預先加有10μl無菌水或LB培養基的PCR管中,吹打混合。

    25ml PCR反應體系:取2μl細菌懸液為模板、加入5μM 濃度的M13F/M13R

    1μl進行PCR擴增。

    PCR擴增條件:95℃預變性5分鐘(裂解細胞,失活核酸酶),94℃變性10鐘,55℃退火10秒鐘,72℃延伸 根據片段的大小決定延伸時間,通常每1min/1kbX秒,30個循環,72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果,有強烈的明顯條帶的克隆為重組體,與插入片段大小相近M13F/M13R 引物在克隆位置的兩側,所以PCR擴增出的DNA的長度比插入片段大138bp 可視為陽性克隆。菌落PCR方法鑒定重組子時一定要設立一個不加菌液的陰性對照。

    (2) 測序:用M13FM13R通用引物對陽性質粒進行測序分析。

    pBM16A載體圖譜

     

     
     
    常見問題分析

     

    重組子克隆菌少,或陽性率低:

    (1) 感受態效率低,使用轉化效率>5×107cfu/µg 的感受態細胞

    (2) 連接反應在低溫下(如放碎冰上)操作,應該在室溫下操作。

    (3) PCR 片段加入量太多或太少,按照推薦量加入。

    (4) PCR 純度低,重新擴增或重新純化PCR 產物。

    (5) PCR 質量低,切膠時在紫外下照射時間長,需重新制備。

    (6) PCR 擴增結束后,應該再延伸5-10 分鐘,確保片段延伸*。

    (7) 轉化后沒有復蘇培養,可以加入SOC LB,培養60分鐘。

    • 克隆基因可能對宿主菌有毒性,比如某些編碼膜蛋白和 DNA 結合蛋白的基因,某些啟動子和調節序列基因,或含有倒置或串聯重復序列的基因,選用室溫過夜培養平板。

     

    載體序列:

    >pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC

                                                               本產品僅供研究不用于臨床診斷

    實驗代做服務:

    ELISA試劑盒免費代檢測

    CCK8檢測

    HE染色

    蛋白相互作用分析

    Western Blot

    免疫組化IHC染色

    熒光定量PCR

    動物模型服務

    流式細胞檢測

    免疫熒光染色

    激光共聚焦

    DNA甲基化實驗

    石蠟/冰凍切片

    透射電鏡服務

    掃描電鏡實驗

    蛋白雙向(2-D)

    動物實驗

    免疫共沉淀

    原位雜交(FIsh

    蛋白質純化

    分子克隆和質粒載體構建服務

    組蛋白甲基化磷酸化乙酰化

     

    蛋白雙向2D-WB

     

    藥理毒理動物實驗

     

    番紅O固綠染色

    明膠酶譜MMP

    酶活性檢測

    動物造模/模型實驗服務

                                        

     

    滬公網安備 31011802001677號

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