pBM16A Toposmart Cloning Kit

保存條件：-20℃保存，有效期一年。

產(chǎn)品介紹：

pBM16A Toposmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點(diǎn)將片段克隆到載體中。不僅適用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴(kuò)增的帶A尾的PCR產(chǎn)物。試劑盒中的pBM16A載體為線性化的質(zhì)粒。可以用引物對(duì)M13F和M13R進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性克隆。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

（1）連接反應(yīng)僅需5 分鐘。

（2）適用于平末端PCR產(chǎn)物和帶A尾的PCR產(chǎn)物。

（3）載體采用了新的制備工藝，無需藍(lán)白斑篩選。

1. 克隆位點(diǎn)兩旁都有Smal和EcoR V酶切位點(diǎn)，適合單酶切鑒定。
2. 載體具有氨芐青霉素抗性。

操作步驟：

1. 連接反應(yīng)

按下表，在一個(gè)0.2ml PCR 管中依次加入加完試劑后，輕輕混勻低速離心，使溶液集中在管底。

 注意：此步驟不要在低溫條件下（冰水浴）上操作。

 2. 反應(yīng)溫度及片段要求

室溫下（20-30℃）放置 0-5 分鐘，然后將離心管放置在冰上。如當(dāng)天不進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)將連接產(chǎn)物置于-20℃保存。

注意：DNA-*片段的用量見下表

室溫下（20-30℃）反應(yīng)時(shí)間 5-30 分鐘，如果室溫較低，推薦使用 PCR 儀器控制溫度。可以設(shè)置 25℃反應(yīng) 5 分鐘。如果 PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)僅有很銳利明亮的條帶，無引物二聚體和非特異性條帶存在，可直接取 0.5-1µl PCR 產(chǎn)物原液進(jìn)行克隆。

3. 陽性對(duì)照反應(yīng)

取1µl 試劑盒提供的1kb長(zhǎng)度的對(duì)照片段LacZ 基因α肽片段進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化具有α 互補(bǔ)功能的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（如 DH5α,*0,Mach1-T1 等）。菌液涂布在含有IPTG,X-gal 的LB 氨芐平板上，次日藍(lán)色菌落為陽性克隆，說明有片段插入，白色菌落為空載體。

4. 轉(zhuǎn)化

1.取5µl 連接產(chǎn)物到50-100µl 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴2-30 分鐘。

2.42℃水浴中熱擊30 秒鐘。

3. 立刻置于冰水浴中2 分鐘。

加入300-500µl 無菌的不含抗生素的SOC 或LB，37℃，200-250rpm 振蕩培養(yǎng)60 分鐘。

注：小于 2kb 片段可以不復(fù)蘇，直接涂平板。

• 吸取200µl 菌液涂布。為了得到更多的菌落，可以先4000rpm 離心1 分鐘，去掉部分上清，用移液器輕吹菌體，充分懸浮菌液，取全部菌液涂布，然后 37℃培養(yǎng)過夜（12-16 小時(shí)）。

5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR

（1） 菌落PCR方法鑒定陽性克隆

① 用10ml吸頭挑選克隆至預(yù)先加有10μl無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中，吹打混合。

② 25ml PCR反應(yīng)體系：取2μl細(xì)菌懸液為模板、加入5μM 濃度的M13F/M13R各

1μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

③PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5分鐘（裂解細(xì)胞，失活核酸酶），94℃變性10秒鐘，55℃退火10秒鐘，72℃延伸（ 根據(jù)片段的大小決定延伸時(shí)間，通常每1min/1kb）X秒，30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，有強(qiáng)烈的明顯條帶的克隆為重組體，與插入片段大小相近（M13F/M13R 引物在克隆位置的兩側(cè)，所以PCR擴(kuò)增出的DNA的長(zhǎng)度比插入片段大138bp） 可視為陽性克隆。菌落PCR方法鑒定重組子時(shí)一定要設(shè)立一個(gè)不加菌液的陰性對(duì)照。

（2） 測(cè)序：用M13F、M13R通用引物對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。

pBM16A載體圖譜

重組子克隆菌少，或陽性率低：

(1) 感受態(tài)效率低，使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/µg 的感受態(tài)細(xì)胞

(2) 連接反應(yīng)在低溫下（如放碎冰上）操作，應(yīng)該在室溫下操作。

(3) PCR 片段加入量太多或太少，按照推薦量加入。

(4) PCR 純度低，重新擴(kuò)增或重新純化PCR 產(chǎn)物。

(5) PCR 質(zhì)量低，切膠時(shí)在紫外下照射時(shí)間長(zhǎng)，需重新制備。

(6) PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，應(yīng)該再延伸5-10 分鐘，確保片段延伸*。

(7) 轉(zhuǎn)化后沒有復(fù)蘇培養(yǎng)，可以加入SOC 或LB，培養(yǎng)60分鐘。

• 克隆基因可能對(duì)宿主菌有毒性，比如某些編碼膜蛋白和 DNA 結(jié)合蛋白的基因，某些啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列基因，或含有倒置或串聯(lián)重復(fù)序列的基因，選用室溫過夜培養(yǎng)平板。