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    單核細胞增生李斯特菌核酸檢測試劑盒 (PCR法)
    更新時間:2021-08-04 點擊量:1355

    單核細胞增生李斯特菌核酸檢測試劑盒 (PCR法)

     

    【產品概述】

    李氏桿菌病是由單核細胞增生李斯特菌引起的一種急性或慢性傳染病。本病可分為子宮炎型、敗血型和腦炎型。在家畜中,綿羊的李氏桿菌病最為常見,并幾乎全為腦炎型,各種年齡和性別的綿羊都可患病;敗血型間或發生于10日齡以下的羔羊;子宮炎型多發生于懷孕最后兩個月的頭胎綿羊。山羊的病型與綿羊的相同。

    本試劑盒應用聚合酶鏈反應(PCR)方法,可快速、準確地定性檢測單核細胞增生李斯特菌DNA,適用于單核細胞增生李斯特菌的檢測、診斷和流行病學調查。

    【檢測原理】

     以提取的待檢樣本的DNA為模板,在PCR反應體系中,低溫條件下引物與互補的模板形成雙鏈,72℃時在Taq DNA 聚合酶作用下,以dNTP 為原料,以引物為復制的起點,沿模板合成一條新鏈。每個循環包括:高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個過程。每一次循環使擴增的DNA 片段拷貝數放大一倍。經過35 次循環,使擴增的DNA 片段放大了數百萬倍以上。將擴增產物進行電泳,經核酸染料染色后,在紫外燈照射下,肉眼可見到DNA 片段的擴增帶。

    【試劑盒組成】

    組成成份

    包裝規格

    核酸擴增試劑


    PCR反應液

    784μl×1管

    PCR酶

    16μl×1管

    質控品


    陰性質控品

    40μl×1管

    陽性質控品

    40μl×1管

    * 質控品說明:陰性質控品用于對環境進行監控,陽性質控品用于對檢測試劑進行監控。

    【自備物品】

    1.   儀器:分析天平、離心機、PCR 擴增儀、電泳儀、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調移液器等;

    試劑DNA提取試劑、核酸染料(如EB、GoldView II)、DNA Marker(如TaKaRa 1.   DL2000)、Loading Buffer、1×TAE(電泳緩沖液)、瓊脂糖、雙蒸水等;

    2.   耗材:稱量紙、吸頭、量筒、500ml錐形瓶等。

    【使用方法】

    注:所有試劑使用前須*解凍,混合均勻后于5,000rpm離心數秒后使用。

    1. 樣本處理(樣本處理區)

    待檢樣本的核酸提取可采用核酸提取試劑盒,具體提取方法請參照相應說明書;陽性質控品及陰性質控品無需提取,已包裝在試劑盒內,可直接使用。

    2. 擴增試劑準備(配液區)

    N個(N=陰性質控品+待檢樣本+陽性質控品)PCR反應管,每管分別加入PCR反應液19.6μl、PCR酶0.4μl (也可按照每頭份用量,計算N+1頭份PCR反應液、PCR酶各自所需總量,兩者混勻離心后分裝20μl至單個PCR反應管)。

    組分

    每頭份用量

    PCR反應液

    19.6μl

    PCR酶

    0.4μl

    擴增試劑加好后將所有PCR反應管于5,000rpm離心10s,轉移至樣本處理區。

    3. 加樣(樣本處理區)

    在上述的PCR反應管中分別加入待檢樣本核酸提取物、陰性質控品和陽性質控品各5μl,蓋緊管蓋,于5,000rpm離心10s,轉移至擴增區。

     4. PCR擴增(檢測區)

             94℃ 3min;

             94℃ 30s

             55℃ 30s

             72℃ 30s

             72℃ 7min;

             4℃  Hold;

             設置25μl體系。

    5. 電泳檢測(電泳區)

    4g瓊脂糖放于500ml錐形瓶中,加入200ml 1×TAE電泳緩沖液,于微波爐中熔解,室溫冷卻10min后加入10μl核酸染料混勻。在電泳槽內放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固后將PCR擴增產物10~20μl,加入終濃度1×的上樣緩沖液,點樣于瓊脂糖凝膠孔中,100~120V電壓在1×TAE電泳緩沖液中電泳至溴酚藍處于凝膠1/2處(約30min),紫外燈下觀察結果。

        【結果判斷】

    陽性對照出現320bp擴增帶、陰性對照無該位置的特異條帶出現(引物帶除外),實驗結果成立,否則視為無效。被檢樣品出現320bp擴增帶為單核細胞增生李斯特菌陽性,否則為陰性。

    【注意事項】

    1. 有關實驗室管理規范請嚴格按照行業行政主管部門頒布的有關基因擴增檢驗實驗室的管理規范執行。

    2. 實驗請嚴格分區操作:流程順序為配液區→樣本提取區→擴增區→電泳區。嚴禁器材和試劑倒流。

    3. 試劑盒內各試劑使用前,充分融化后請稍事離心。

    4. -20℃保存的樣本裂解產物,應在加樣前置室溫解凍,作短暫離心后使用。

    5. 核酸染料低毒,應于室溫條件避光保存,操作時應戴上手套,染料和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底。

    6. 嚴格遵守操作說明可以獲得最H的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

    7. 反復凍融試劑將減低檢測靈敏度,建議在3次內用完,請嚴格按試劑盒說明書操作。

    【儲存條件及有效期】

    -20℃保存,避免反復凍融,有效期6個月。

     

    實驗代做服務:

    ELISA試劑盒免費代檢測

    CCK8檢測

    HE染色

    蛋白相互作用分析

    Western Blot

    免疫組化IHC染色

    熒光定量PCR

    動物模型服務

    流式細胞檢測

    免疫熒光染色

    激光共聚焦

    DNA甲基化實驗

    石蠟/冰凍切片

    透射電鏡服務

    掃描電鏡實驗

    蛋白雙向(2-D)

    動物實驗

    免疫共沉淀

    原位雜交(FIsh

    蛋白質純化

    分子克隆和質粒載體構建服務

    組蛋白甲基化磷酸化乙酰化

     

    蛋白雙向2D-WB

     

    藥理毒理動物實驗

     

    番紅O固綠染色

    明膠酶譜MMP

    酶活性檢測

    動物造模/模型實驗服務



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