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    土霉素試劑盒檢測(組織、牛奶、飼料、蜂蜜)
    更新時間:2022-09-14 點擊量:1277

    土霉素酶聯免疫試劑盒說明書

    一、藥物概述及檢測原理

     歐盟第675/92號令中初步規定在肌肉及牛奶中的四環素族化合物的總量不得超過100ppb,在腎臟,肝臟及雞蛋中分別不得超過600 ppb,300 ppb200ppb

    本公司的土霉素酶聯免疫試劑盒使用全新一代生物技術開發,具有方便、快速、靈敏等特點。

    本試劑盒利用土霉素抗體與土霉素可產生特異性結合的性質,先在酶標板上預包被抗原,再加入標準品(樣本)和土霉素抗體,樣本土霉素藥物與固定在酶標板上的抗原競爭土霉素抗體,最后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標準品(樣本)中土霉素藥物的含量成反比。

     

    二、試劑盒內包含組分:

    10×標準品濃縮液:0 ppb、4ppb、12 ppb、36 ppb108 ppb0.5mL/瓶。

    96孔酶標板:1

    土霉素抗體工作液:1瓶(7mL/瓶)

    酶標二抗工作液:1瓶(7mL/瓶)

    20×濃縮洗滌液:1瓶(30 mL/瓶)

    20×濃縮復溶液:1瓶(10 mL/瓶)

    底物A液:1瓶(7 mL/瓶)

    底物B液:1瓶(7 mL/瓶)

    終止液:1瓶(7mL

    說明書

    蓋板膜

    三、用戶需要自備的設備和試劑

    儀器:

    酶標儀(檢測波長450 nm630 nm

    電子天平(精度:0.01 g

    離心機(4000 g及以上)

    生化培養箱(可調25℃、37℃、60℃)

    旋渦振蕩器

    微量移液器:(20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍)

    計時器

    試劑:(試劑均為分析純

    去離子水

     

    四、試劑盒特異性

       試劑盒與其他藥物的交叉反應率:

    土霉素…………………………100%

    金霉素…………………………240%

    四環素…………………………200%

    強力霉素(多西環素)……………………20%

     

    五、樣本檢測步驟

    1. 工作液準備

    復溶工作液:取120×濃縮復溶液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

    洗滌工作液:120×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

    1 M鹽酸溶液:量取1ml濃鹽酸加去離子水11ml溶解混勻即得。

    2. 樣品前處理

    組織樣本(稀釋倍數:12

    準確稱取1±0.01 g均質后的組織樣品于10 mL離心管中;

    加入5 mL去離子水,劇烈渦動2min;

    4000 g以上,離心10 min;

    500ul上清液加入500ul復溶工作液(見5.1)中,渦動10min

    50ul進行檢測。

    蜂蜜樣本(稀釋倍數:10

    精確稱取1±0.01g蜂蜜樣品于10mL離心管中;

    加入2mL去離子水,充分渦動1 min溶解分散;

    100ul溶解液加入400ul復溶工作液中,渦動1 0S混勻;

    立即取50ul進行檢測。

    液態奶樣本方法一(稀釋倍數:10)(同卡那霉素液態奶方法一致)

    采樣好的液態奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上;

    將槍頭伸入原奶樣本下層,小心取出1ml樣本加入2ml離心管中(注意:盡量不要取到上層的奶油);

    加入50μL 1M鹽酸(見5.1),強烈震搖1min (或使用渦動儀渦動30s);

    使用離心機室溫4000 g以上離心10 min;

    取上層清亮液體50μL加入另一干凈離心管中(注意:盡量不要取到最上層的奶油),再加入450μL復溶工作液,強烈震搖1min (或使用渦動儀渦動30s);

    50 μL液體進行分析。

    液態奶樣本方法二(稀釋倍數:40)(同卡那霉素液態奶方法一致)

    精確量取50ul液態奶樣品于1950ul復溶工作液中;

    充分渦動1 min混勻;

    立即取50ul進行檢測。

    飼料(牛飼料、豬飼料)(稀釋系數:200

    準確稱取 1±0.01 g 飼料樣品于 50mL 離心管中;

    加入 5 mL 去離子水,充分渦動 2min 至飼料*分散;

    4000 g 以上,離心 10 min;

    40 μL上清液于新的離心管中,加入1560μL 復溶工作液 ,充分渦動 30 s

    立即取 50μL 進行檢測。

    3. 檢測

    準備:將要使用的酶標板條插入酶標板架上,并記錄各標準品和樣品的位置,為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗(每個樣本/標準品點兩孔),未使用的酶標板條用自封袋密封后,保存于2-8℃環境中以防變質;

    標準品工作液配制:分別取52ml離心管,標記為00.41.2、3.610.8ppb;于每個管中加入900ul復溶工作液,于對應管中加入100ul10×標準品濃縮液000.4—4、1.2—123.6—36、10.8—108);

    加樣:向對應微孔中加入標準品工作液/樣品溶液50 μL,再向每孔中加入50 μL酶標二抗工作液,再向每孔中加入50 μL抗體工作液;

    孵育:輕輕振蕩酶標板10 s,使孔內液體充分混勻后,蓋好蓋板膜于25℃避光反應30 min

    洗滌:取出酶標板后小心揭開蓋板膜,倒出板孔中液體后,在每孔加 250 μL洗滌工作液,浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液,然后再加入洗滌工作液重復洗滌3~4次后,將酶標板倒置于吸水紙上,用力拍干;

    顯色:在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液(注:底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合,混合液在10 min內使用,切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質失效);

    孵育:輕輕振蕩酶標板10 s,使孔內液體充分混勻后,蓋好蓋板膜于25℃避光反應15 min;

    終止:在反應后的微孔中加入終止液50μL/孔,底物液由藍變黃表明終止成功。

    讀數:終止后的酶標板應在5 min內用酶標儀讀數,建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標板吸光度值。

    4. 計算結果

    設各標準品(或樣品)的吸光度平均值為B,零標準(濃度為0 ppb的標準品)吸光度平均值B0(B/B0)×100%為各標準品(或樣品)對應的吸光度的百分比:

    使用半對數系統代入標準品對應的吸光度的百分比,與標準品濃度擬合出標準曲線。

    將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中,即可得出樣品對應的濃度,最后乘以樣品相應的稀釋倍數,即可得出樣品中檢測物含量。

     

    六、試劑盒參數

    試劑盒靈敏度:0.4 ppb;

    標準曲線范圍:0.4 ppb-10.8ppb

    板內變異系數:<5%;

    板間變異系數:<15%;

    B0吸光度最佳值:>0.8

    回收率:90%±15%

    樣品最低檢測限:

      組織……………………………約12ppb

       蜂蜜……………………………約20ppb

       液態奶樣本方法一……………約20ppb

       液態奶樣本方法二……………約40ppb

       飼料……………………………約600ppb

    注:ppb=ng/mLng/g。

     

    七、分析限制

       本試劑盒為定量或半定量試劑盒,建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結果為陽性,建議使用儀器方法開展確證實驗(如GC/MSLC-MS/MS等)。

     

    八、試劑盒貯存條件

    試劑盒最佳貯存溫度為2-8℃,切勿凍存。

    未使用完的酶標板須密封保存2-8℃的環境中。

     

    九、注意事項

    使用試劑盒前,請務必仔細閱讀說明書。

    試劑盒使用前,需將盒內各組份置于實驗臺上回溫至室溫(25±2℃)(提示:約1 h)。

    試劑使用前需搖勻,混合時應避免出現氣泡。

    槍頭為一次性用品,為防止試劑交叉污染,檢測過程中所用槍頭不得重復使用。

    請勿使用過期試劑盒,不同批號試劑盒中的試劑不得混用。

    樣品處理完畢后請立即分析,否則可能影響檢測結果。

    底物A液、底物B液均為無色透明液體,若在使用前已變成藍色,或混合后立即變藍,說明試劑已污染或變質。

    加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速,以免反應時間差對檢測結果產生影響。

    終止液中含有硫酸,若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水沖洗。若不慎入眼,請在*清洗后去醫院檢查。

     

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