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    人線粒體呼吸鏈復合物IELISA試劑盒說明書
    更新時間:2015-07-13 點擊量:778

    人線粒體呼吸鏈復合物I 酶聯免疫分析試劑盒使用說明書

    本試劑僅供研究使用 目的:本試劑盒用于測定人血清,血漿,細胞
    上清及相關液體樣本中線粒體呼吸鏈復合物I 的活性。
    實驗原理:
    本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人線粒體呼吸鏈復合物I 水平。用純化的人線粒
    體呼吸鏈復合物I 抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入線粒體呼
    吸鏈復合物I,再與HRP 標記的線粒體呼吸鏈復合物I 抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗
    體復合物,經過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉化成藍色,并在
    酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的線粒體呼吸鏈復合物I 呈正相關。用
    酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),通過標準曲線計算樣品中人線粒體呼吸鏈復
    合物I 活性濃度。
    試劑盒組成:
    試劑盒組成48 孔配置96 孔配置保存
    說明書1 份1 份
    封板膜2 片(48) 2 片(96)
    密封袋1 個1 個
    酶標包被板1×48 1×96 2-8℃保存
    標準品:27U/mL 0.5ml×1 瓶0.5ml×1 瓶2-8℃保存
    標準品稀釋液1.5ml×1 瓶1.5ml×1 瓶2-8℃保存
    酶標試劑3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
    樣品稀釋液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
    顯色劑A 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
    顯色劑B 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
    終止液3ml×1 瓶6ml×1 瓶2-8℃保存
    濃縮洗滌液(20ml×20 倍)×1 瓶(20ml×30 倍)×1 瓶2-8℃保存
    樣本處理及要求:
    1. 血清:室溫血液自然凝固10-20 分鐘,離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上
    清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。
    2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20 分鐘后,離心
    20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次
    離心。
    3. 尿液:用無菌管收集,離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清,保存過程
    中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
    2
    4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/
    分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞
    濃度達到100 萬/ml 左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20 分
    鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
    5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備
    用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器
    將標本勻漿充分。離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待
    檢測,其余冷凍備用。
    6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上
    進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.
    7. 不能檢測含NaN3 的樣品,因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
    操作步驟:
    1. 標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10 孔,在*、第二孔中分別加標
    準品100μl,然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻;然后從*孔、第二
    孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,
    混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉,再各取50μl 分別加到第五、第六孔
    中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各
    取50μl 分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混
    勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準
    品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl 棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,
    濃度分別為18U/mL,12U/mL ,6U/mL,3U/mL,1.5U/mL)。
    2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣
    品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣
    品zui終稀釋度為5 倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混
    勻。
    3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
    4. 配液:將30(48T 的20 倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T 的20 倍)倍稀釋后備用。
    5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒后棄去,如此
    重復5 次,拍干。
    6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
    7. 溫育:操作同3。
    8. 洗滌:操作同5。
    9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
    15 分鐘.
    10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
    11. 測定:以空白空調零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。測定應在加終止
    液后15 分鐘以內進行。
    注意事項:
    1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未
    用完,板條應裝入密封袋中保存。
    2. 濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
    3. 各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間
    3
    控制在5 分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。
    4. 請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD 值
    大于標準品孔*孔的OD 值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n 倍)后再測定,計
    算時請zui后乘以總稀釋倍數(×n×5)。
    5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
    6. 底物請避光保存。
    7. 嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
    8. 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
    9. 本試劑不同批號組分不得混用。
    10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。
    計算:
    以標準物的濃度為橫坐標,OD 值為縱坐標,
    在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD
    值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋
    倍數;或用標準物的濃度與OD 值計算出標
    準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD 值
    代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋
    倍數,即為樣品的實際濃度。
    (此圖僅供參考)
    試劑盒性能:
    1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R 值為0.95 以上。
    2.批內與批見應分別小于9%和11%
    檢測范圍:
    1U/mL - 25U/mL
    保存條件及有效期:
    1.試劑盒保存:;2-8℃

    2.有效期:6 個月

    滬公網安備 31011802001677號

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